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Title: Riattivazione del Polyomavirus umano JC in pazienti affetti da malattie immuno-mediate e trattati con farmaci biologici: analisi di sequenza della Non Coding Control Region virale ed indagine immunofenotipica
Authors: BELLIZZI, ANNA
Tutor: Ciardi, Maria
Pietropaolo, Valeria
Keywords: Polyomavirus umano JC e PML
Rischio di PML in malattie immunomediate trattate con farmaci biologici
Anticorpi monoclonali: natalizumab e anti-TNF-alfa
Carica virale di JCV nel plasma e nelle urine e analisi di sequenza della NCCR e della VP1 virali
Valutazione citofluorimetrica dell’espressione del CD49d sui linfociti
Issue Date: 18-Jun-2014
Abstract: Negli ultimi anni, il trattamento di molte malattie immunomediate ha previsto l'impiego di anticorpi monoclonali (mAbs), i rappresentanti più promettenti nella categoria dei farmaci biologici (FB). Tuttavia il loro uso è stato presto associato alla riattivazione di agenti patogeni latenti, come il Polyomavirus umano JC (JCV), un virus neurotropo ed ubiquitario nella popolazione umana, con un genoma a DNA circolare a doppio filamento. L'allarme di “infezioni opportunistiche associate all’utilizzo di FB” è scattato nel 2005 quando 3 pazienti, trattati con l’mAb natalizumab, hanno sviluppato la leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML), rara malattia demielinizzante del sistema nervoso centrale (SNC) causata all’infezione litica degli oligodendrociti da parte di JCV. L’α4-integrina (o CD49d) rappresenta il bersaglio specifico dell’mAb natalizumab, che agisce bloccando la diapedesi dei linfociti T CD4+ e CD8+ attivati verso i loci d’infiammazione. A livello del SNC, tale diapedesi linfocitaria è mediata dall’interazione tra l’α4-integrina, presente sui linfociti, e le molecole di adesione cellulare VCAM-1, presenti sull’endotelio vascolare cerebrale. Tuttavia, il preciso meccanismo mediante il quale il natalizumab predisponga al rischio d’insorgenza di PML non è stato ancora ben definito, anche se tale meccanismo sembra dipendere fortemente sia da una ridotta sorveglianza immunitaria del SNC, sia dall’infezione latente da parte di JCV delle cellule B e dei precursori ematopoietici CD34+ che, migrando attraverso la circolazione sanguigna, possono trasferire le varianti più neurovirulente di JCV dal midollo osseo al cervello. I determinanti del neurotropismo e della neurovirulenza di JCV risiedono principalmente nella regione non codificante di controllo della replicazione e della trascrizione genica virale (NCCR), una regione altamente variabile che va incontro a riarrangiamenti nel corso della replicazione virale. La NCCR della variante non patogena di JCV (archetipo CY) è divisa in 6 box indicati come: box A di 36 paia di basi (pb), box B (23pb), box C (55pb), box D (66pb), box E (18pb) e box F (69pb). Ciascun box contiene i siti di legame per specifici fattori trascrizionali cellulari coinvolti nella trascrizione dei geni virali. Questi siti di legame possono andare incontro a processi di riarrangiamento, come delezioni o duplicazioni, generando nuove varianti virali dotate di diverso tropismo e grado di patogenicità rispetto al ceppo archetipo. Le varianti patogene così generatesi ed isolate prevalentemente da tessuti di pazienti con PML possiedono invece una NCCR con un’organizzazione strutturale che rimanda al prototipo originale Mad1. La NCCR di Mad1 è costituita da una sequenza A-C-E di 98 pb ripetuta in tandem (A-C-E-A-C-E-F), con conseguente duplicazione dei siti di legame specifici per particolari fattori di trascrizione cellulare, tra cui NF-1 ed Spi-B, essenziali per l’espressione dei geni virali. Pertanto, per stabilire l’esistenza di una correlazione tra la riattivazione di JCV ed il trattamento di malattie immunomediate con FB, sono state arruolate quattro coorti di individui: due coorti di pazienti pediatrici affetti da morbo di Crohn (MC) trattati rispettivamente con l'anti-TNF-α infliximab (Coorte 1.1), e con terapia convenzionale a base di antinfiammatori e antibiotici (Coorte 1.2); una coorte di pazienti affetti da sclerosi multipla recidivante-remittente (SMRR) trattati con natalizumab (Coorte 2); ed una coorte di pazienti affetti da malattie reumatiche infiammatorie croniche (MRIC) trattati con mAbs anti-TNF-α differenti (Coorte 3). I principali obiettivi di questo studio sono stati: (1) il monitoraggio della carica virale di JCV mediante PCR Real Time quantitativa (q-PCR) in prelievi biologici raccolti dalle tre coorti a tempi di campionamento specifici; (2) l’analisi dei possibili riarrangiamenti della NCCR virale, al fine di individuare possibili mutazioni nei siti di legame per specifici fattori di trascrizione cellulari; (3) l’analisi della sequenza genica della VP1 di JCV, al fine di definire una possibile correlazione tra uno specifico genotipo/sottotipo di JCV e le malattie immunomediate in trattamento con FB; (4) l’analisi immunofenotipica e la valutazione dell’immunoattivazione e dell’espressione del CD49d sulla membrana cellulare delle varie sottopopolazioni linfocitarie mediante citoflurimetria, al fine di individuare le alterazioni immunologiche indotte dal natalizumab, esclusivamente nei pazienti affetti da SMRR. Dall’analisi dei risultati ottenuti è emerso che, nelle coorti di pazienti pediatrici affetti da MC, la carica virale di JC nel plasma (o viremia) è risultata significativamente più elevata nella Coorte 1.1 rispetto alla Coorte 1.2 dopo 4 mesi di trattamento, momento in cui l’infliximab sembra raggiungere la sua massima efficacia, determinando la mobilizzazione dei precursori emopoietici CD34+ infettati con JCV. Nelle urine e nelle biopsie ileali, invece, la carica virale è aumentata in modo significativo nella Coorte 1.1 rispetto alla Coorte 1.2 dopo 1 anno di trattamento con infliximab. Pertanto, è probabile che l’utilizzo prolungato del farmaco, riducendo l’immunosorveglianza dell’ospite, favorirebbe l’infezione produttiva da parte di JCV sia delle cellule epiteliali tubulari del rene sia delle cellule gliali enteriche, quest’ultime ritenute siti di latenza secondaria per il virus. In questo contesto, i virioni prodotti dalle cellule gliali enteriche potrebbero aver infettato le cellule epiteliali intestinali facilitando la diffusione del virus nel tratto gastrointestinale. Infine sia a 12 e a 18 mesi di trattamento con infliximab, la carica virale di JC nelle urine (o viruria) si è mostrata significativamente più elevata rispetto alla viremia (p < 0,05) solo nella Coorte 1.1. Nella Coorte e invece, durante i primi 8 mesi di trattamento con anti-TNF-α, è stata osservata una viruria persistente da JC significativamente più elevata rispetto alla viremia (p=0,015), portando ad ipotizzare che sia la patologia primaria che l’utilizzo di anti-TNF-α favoriscano la riattivazione del virus a livello dell’epitelio dell’apparato urinario con conseguente rilascio dei virioni di JC nell’urina. Infine, nella coorte di pazienti con SMRR trattati con natalizumab, è stata riscontrata un’associazione statisticamente significativa (p=0,0006) tra il numero di campioni di urina positivi al DNA di JCV e la presenza di anticorpi JCV-specifici (STRATIFY JCV® positivo) dopo un anno di trattamento con natalizumab (t3), rispetto al numero di campioni di urina positivi al DNA di JCV e l’assenza di anticorpi JCV-specifici (STRATIFY JCV® negativo). Pertanto l’andamento della viruria potrebbe essere considerato un indice predittivo di riattivazione del virus JC nei primi 12 mesi di trattamento con natalizumab in pazienti affetti da SMRR soprattutto nei casi in cui lo STRATIFY JCV® fornisca un risultato negativo. Inoltre in pazienti con un numero di infusioni superiori a 12 è stato stimato un rischio relativo pari a 1,71 di sviluppare viremia da JCV rispetto ai pazienti con un numero di infusioni di JCV inferiore a 12 (p=0,04). Infine, esclusivamente nella Coorte 2 è stata condotta la valutazione dell’espressione del CD49d sulla membrana cellulare di varie sottopopolazioni linfocitarie presenti nel sangue periferico e, dall’analisi dei risultati ottenuti, è stato possibile osservare una riduzione significativa dell’espressione dell’α4-integrina nei linfociti T CD4 central memory (p = 0,036), CD4 effector memory (p = 0,012) e CD8 effettori (p = 0,043) dei pazienti affetti da SMRR con viremia e/o viruria da JCV rispetto a quella dei pazienti senza viruria e senza viremia durante il primo anno di trattamento con natalizumab. Infine dal confronto tra le varie coorti arruolate in questo studio, è emerso che la viruria nei pazienti affetti da MRIC è sempre maggiore rispetto a quella riscontrata nelle altre coorti (p=0,025) e che esiste una correlazione statisticamente significativa tra la viruria da JC al baseline (prima dell’inizio del trattamento con FB) e l’essere affetto da MRIC (p=0,024). Inoltre, i valori di viremia (p=0,046) e di viruria (p=0,008) sono sempre più elevati nella coorte dei pazienti affetti da MRIC rispetto a quelli dei pazienti con MSRR e che il rischio di viruria persistente da JC è più elevato durante il trattamento con anti-TNF-α rispetto a che al trattamento con natalizuamb (p=0,01). Per quanto riguarda invece l’analisi di sequenza della NCCR di JCV, nella Coorte 1.1 è stata riscontrata la presenza di un’organizzazione strutturale tipica della variante non patogena di JCV (archetipo CY) nel 72% delle sequenze analizzate, mentre nel 26% è stata riscontrata un’organizzazione CY-simile ma con una delezione del box D e/o la presenza di due mutazioni nucleotidiche ricorrenti: la trasversione da T a G all’interno del sito di legame per il fattore di trascrizione cellulare Spi-B e la transizione da G a A nel box F all’interno del sito di legame per il fattore di trascrizione cellulare NF-1. In particolare, l’identificazione della mutazione nucleotidica a livello del sito di legame per il fattore di trascrizione cellulare Spi-B, la cui espressione è elevata nelle linee cellulari ematopoietiche, come le CD34+ e le cellule B, permette di correlare la presenza di questa mutazione puntiforme con una maggior capacità di diffusione del virus nell’ospite. Inoltre la transversione nucleotidica da T a G, converte il tipico sito di legame per il fattore cellulare Spi-B (5'-AAAAGGGAAGGTA-3') della variante non patogena archetipo CY in quello caratteristico delle varianti PML-associate come Mad1 (5'-AAAAGGGAAGGGA-3'), favorendo la riattivazione del virus ed il processo di riarrangiamento della NCCR. È stato infatti osservato da altri Autori che questa mutazione porti ad un aumento della trascrizione dei geni precoci di JCV, in quanto il sito di legame per Spi-B delle varianti PML-associate possiedono un’affinità di legame maggiore per la proteina cellulare rispetto al sito di legame presente nella variante non patogena [Marshall et al., 2012]. Infine nel restante 2% delle sequenze analizzate, ritrovate in 2 biopsie colon-rettali, è stata identificata una particolare sequenza riarrangiata della NCCR, con un’organizzazione strutturale che richiama la sequenza della NCCR del ceppo virale patogeno Mad1. Dal momento che le cellule epiteliali intestinali non sono permissive alla replicazione del virus, la presenza di tali sequenze evidenzia l’importanza dei meccanismi di riarrangiamento della NCCR al fine di generare varianti dotate di una migliore fitness replicativa. Negli ultimi anni il ritrovamento del DNA di JCV in cellule non permissive alla replicazione virale ha indotto a riconsiderare nell’uomo le potenzialità oncogene del virus JC, attualmente dimostrate solo in vitro. Nella Coorte 2, invece, è stata riscontrata un’organizzazione strutturale di tipo archetipo CY nel 68% dei campioni analizzati, mentre nel restante 32% sono state individuate sequenze riarrangiate e/o con caratteristiche mutazioni nucleotidiche. In particolare, in 2 campioni di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), appartenenti a 2 diversi pazienti con SMRR e STRATIFY JCV® positivi a t3, è stata ritrovata una NCCR riarrangiata, caratterizzata dalla delezione del box B con trasversione da T a G all’interno del sito di legame per il fattore di trascrizione cellulare Spi-B, dalla duplicazione del box C e dalla presenza dei box D, E ed F. Infine, nella coorte dei paziente affetti MRIC ed in trattamento per 8 mesi con anti-TNF-α, è stata sempre riscontrata l’organizzazione strutturale della NCCR archetipo, ad eccezione di un’unica sequenza riarrangiata simil-Mad1. Per quanto riguarda infine l’analisi della sequenza della VP1 virale, in tutte le coorti arruolate è stata osservata una prevalenza dei genotipi 1A e 1B, che sono quelli più comunemente riscontrati nelle popolazioni europee. Pertanto, sebbene non sia stato possibile individuare una reale correlazione tra la presenza di varianti neurovirulente ed il trattamento con specifici farmaci biologici, da questo studio è emerso che durante la diffusione del virus nell'ospite si vadano a selezionare particolari sequenze della NCCR di JCV, e che il trattamento con anticorpi monoclonali sembri avere un ruolo nella selezione di tali varianti. Tuttavia rimane ancora da chiarire quali siano i fattori virali e dell’ospite alla base di questo processo di selezione. Inoltre, dai risultati di questo studio è stato possibile evincere l’importanza di comprendere se e come lo scenario infiammatorio specifico delle diverse patologie immunomediate possa determinare la riattivazione del virus JC dai suoi siti di latenza, anche se sembrerebbe che gli anti-TNF-α favoriscano la riattivazione di JCV a livello dell’epitelio renale rispetto a quanto non faccia il natalizumab. Anche l’analisi della sequenza della NCCR potrebbe in futuro rivelarsi utile per identificare precocemente quei pazienti con un rischio più elevato di sviluppo di PML, in particolare attraverso il ritrovamento di varianti neurovirulente circolanti nel sangue periferico. Infine, la marcata riduzione dell’espressione dell’α4-integrina sulle cellule linfocitarie deputate al controllo dell’infezione e della riattivazione di JCV in pazienti affetti da SMRR che hanno sviluppato viruria e/o viremia da JCV nel primo anno di trattamento con natalizumab, potrebbe rappresentare in futuro un valido marcatore precoce della riattivazione di JCV in pazienti trattati con natalizumab. Pertanto, dal momento che il numero di pazienti affetti da malattie immunomediate e trattati con FB è in continuo aumento, il monitoraggio della riattivazione di JCV potrà rivelarsi estremamente utile nel corso della valutazione del rischio d’insorgenza di PML. Tuttavia, rimane di fondamentale importanza l’integrazione di queste osservazioni con lo studio dell’interazione molecolare, nelle cellule infettate, tra i cofattori proteici cellulari, come Spi-B, ed i corrispettivi siti di legame specifici presenti sulla NCCR virale, nonché la focalizzazione dell’attenzione sui pathways cellulari, finemente regolati dal sistema immunitario dell'ospite, che portano alla riattivazione del virus in condizioni di immunodepressione, dal momento che, fino ad oggi, il trattamento della PML con farmaci anti-virali si è rivelato inefficace.
Description: Tesi di dottorato
URI: http://hdl.handle.net/10805/2523
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