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Title: Definizione della nicchia staminale nella colecisti normale e patologica: isolamento, caratterizzazione,differenziazione, dimostrazione dell’abilità delle cellule staminali isolate di rigenerare il tessuto epatico in modelli sperimentali di danno epatico ed efficace criopreservazione.
Authors: GENTILE, RAFFAELE
CARDINALE, VINCENZO
Tutor: ALVARO, DOMENICO
Keywords: Colecisti
cellule staminali
Issue Date: 26-Jun-2014
Abstract: All'interno delle ghiandole peribiliari dell’albero biliare umano adulto sono state evidenziate cellule staminali che esprimono marcatori di endoderma primitivo. Le stesse cellule hanno dimostrato di possedere la capacità di differenziarsi in vitro e in vivo in epatociti e colangiociti maturi e insule pancreatiche funzionanti. Nulla è finora conosciuto sull’esistenza di cellule staminali/progenitrici nella colecisti umana. Gli obiettivi dello studio sono stati la caratterizzazione della nicchia staminale della colecisti umana, la possibilità di isolare cellule staminali di origine endodermica dalla colecisti umana normale o patologica e la definizione delle condizioni ideali per la loro criopreservazione. N° 19 colecisti sono state ottenute da donatori cadavere adulti esenti da patologie epato-bilio-pancreatiche attraverso il Consorzio Regionale Trapianti d’Organo del Lazio (Italia). N°14 colecisti patologiche sono state prelevate da pazienti affetti da litiasi sintomatica o da pazienti affetti da litiasi asintomatica sottoposti ad exeresi chirurgica in corso di chirurgia bariatrica. Il tessuto colecistico è stato digerito con collagenasi e DNAsi e la sospensione cellulare è stata sottoposta ad immunoselezione per un marcatore di cellule staminali di origine endodermica (EpCAM-Epithelial Cell Adhesion Molecule). Le colture cellulari ottenute sono state mantenute in coltura in Kubota’s Medium (KM), un mezzo di coltura privo di fattori di crescita sviluppato per l’espansione di cellule staminali epatiche in vitro. La valutazione della multi potenzialità è stata effettuata in vitro utilizzando mezzi di coltura a base di KM arricchiti con fattori di crescita e di induzione specifici per i diversi destini maturi di derivazione endodermica (epatociti, colangiociti, isole pancreatiche). Risultati: La colecisti non contiene ghiandole peribiliari, tuttavia, all’interno delle cripte della mucosa colecisti umana sono state individuate popolazione cellulari che esprimono marcatori di cellule progenitrici bilio-pancreatiche (SOX17, PDX1, EpCAM) e di cellule di endoderma primitivo (CXCR4). I risultati dell’analisi morfologica e fenotipica della colecisti patologica sono paragonabili a quelli ottenuti nelle colecisti normali. Cellule immunoselezionate per EpCAM dalla colecisti umana si espandono clonogenicamente su plastica e in un mezzo privo di siero adattato per progenitori endodermici (KM). Cellule isolate dalle colonie, dopo un mese di coltura in KM, sono state trasferite in tre distinti medium bidimensionali ed hanno dato origine a colonie cellulari con caratteristiche epatocitarie, colangiocitarie e di insule pancreatiche funzionanti. Abbiamo condotto studi pre-clinici in modelli sperimentali di epatopatie (topi immunodeficenti SCID) trattati per 7 settimane con trettracloruro di carbonio (CCL4) attraverso l’utilizzo di cellule staminali/progenitrici della colecisti umana (human gallbladder stem/progenitor cells, hGSCs). Al termine gli animali sono stati sacrificati e dopo aver valutato l’attecchimento, la proliferazione, la differenziazione in vivo, abbiamo dimostrato, analizzando i test funzionali sul siero dei topi sacrificati, che solo i topi trattati con le hGSCs mostrano un miglioramento degli indici sierologici di funzionalità epatica. Al fine di individuare la migliore strategia per la criopreservazione delle hGSCs, è stato condotto uno studio in cui sono state analizzate soluzioni criopreservanti con diversa composizione. E’ stata identificata una metodica efficace per il congelamento di cellule staminali/progenitrici, comprese le hGSCs. Le hGSCs sono facilmente isolabili da tessuti umani di donatori di ogni età ed immediatamente utilizzabili per la creazione di banche di cellule staminali/progenitrici che possono essere conservate e utilizzate in pazienti con grave e letale compromissione della funzione del fegato, i quali spesso non sopravvivono all’attesa del trapianto di fegato.
URI: http://hdl.handle.net/10805/2532
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